diatech newsletter
numero 10 | luglio | 2010

In questa newsletter siamo lieti di ospitare il Dr. Stefano Pizzolitto, Direttore della Struttura Operativa Complessa di Anatomia Patologica dell’Azienda Ospedaliero-Universitaria Santa Maria della Misericordia di Udine.

Determinazione dell’assetto genico di KRAS e BRAF nei carcinomi colorettali mediante pyrosequencing: l’esperienza del gruppo di Udine all’ESMO 2010 di Barcellona

I costanti miglioramenti nella conoscenza degli eventi genetici alla base dello sviluppo dei tumori, della loro progressione e dell’attività metastatica, hanno permesso negli ultimi anni un significativo e diretto impatto sulle strategie terapeutiche dei pazienti affetti da neoplasie maligne. Da tempo la sezione di Patologia Molecolare della Struttura Operativa Complessa di Anatomia Patologica dell’Azienda Ospedaliero-Universitaria Santa Maria della Misericordia di Udine, diretta dal dott. Stefano Pizzolitto, si dedica all’identificazione di biomarcatori molecolari allo scopo di guidare le decisioni cliniche nel trattamento oncologico. Il frutto del lavoro volto alla ricerca delle mutazioni del gene KRAS in carcinomi colorettali metastatici si è concretizzato nella produzione di un contributo scientifico che è stato presentato a Barcellona dal 30 giugno al 3 luglio scorsi all’ESMO Conference: 12th World Congress on Gastrointestinal Cancer at CCIB.
Si tratta di un importante contributo sulla predittività di risposta ai farmaci inibitori di EGFR nei pazienti con carcinoma del colon in fase avanzata. Lo studio si è avvalso di 122 casi di pazienti affetti da carcinoma colorettali metastatici in cui sono state ricercate specifiche mutazioni di K-RAS e di B-RAF sul tumore primitivo e sulle metastasi, sincrone o metacrone. Nel prossimo congresso nazionale SIAPEC che si terrà a Bologna i prossimi 21-25 settembre verranno presentati ulteriori 188 casi, per un totale di 346 campioni provenienti da 210 pazienti.
La valutazione delle mutazioni di KRAS e BRAF è stata condotta con tecnologia Pyrosequencing su DNA estratto dai tessuti tumorali ottenuti da blocchetto paraffinato, utilizzando i test “Anti-EGFR MoAb response® (KRAS status)” e “Anti-EGFR MoAb response® (BRAF status)” della Diatech. I risultati ottenuti hanno evidenziato una percentuale di mutazioni pari al 49% per K-RAS e B-RAF che risulta ancora superiore per la casistica che verrà presentata al Congresso Nazionale SIAPEC.
Le mutazioni per K-RAS e per B-RAF sono risultate, nella coorte di studio, mutualmente esclusive. Il pattern di mutazioni ha rispettato nelle frequenza le proporzioni attese. In 2 pazienti è stata riscontrata la mutazione Q61H a carico del codone 61 e 4 casi hanno rivelato la presenza di mutazione A146T a carico del codone 146. In 4 tumori è stata identificata la mutazione V600E del gene BRAF.
L’importanza dello studio appare avvalorata dal rilevamento di una frequenza di mutazioni più alta rispetto a quella riportata sinora in letteratura grazie anche alla possibilità di identificare mutazioni rare, come quelle nei codoni 61 e 146 di KRAS e quelle a carico di BRAF. Questo permetterebbe di spiegare il motivo per cui pazienti definiti wild-type per i codoni 12 e 13 non trovano comunque giovamento dalla terapia con farmaci anti-EGFR, in quanto portatori di mutazioni negli altri codoni. La maggiore frequenza di mutazioni rilevata nello studio rispetto ai valori riportati in letteratura, si rifletterebbe in una maggiore sensibilità del metodo di sequenziamento con tecnologia Pyrosequencing.
Tale sensibilità ha permesso inoltre di ottenere ottimi risultati anche in presenza di campioni tissutali molto scarsi o con componenti neoplastiche molto esigue, come quelli bioptici endoscopici che nella casistica sopra riportata rappresentavano il 30%.
Le conclusioni cui giunge il lavoro del gruppo di Udine del Dott.Pizzolitto sono che la tecnologia di pyrosequenziamento rappresenta allo stato attuale una promettente tecnologia, ampiamente affidabile e altamente sensibile, facilmente implementabile nella routine clinica di laboratorio, anche per la sua facilità di impiego e per la rapidità di esecuzione complessiva dei test potenzialmente fruibile al clinico in 2 giorni.
I dati ottenuti dalla continuazione del lavoro presentato all’ESMO Conference: 12th World Congress on Gastrointestinal Cancer at CCIB continuano ad avvalorare i risultati discussi a Barcellona ed aprono lo scenario per lo studio di altri biomarcatori molecolari EGFR-mediati coinvolti nella cascata di trasduzione del segnale e volti alla definizione della terapia maggiormente efficace per ciascun paziente

Si ringraziano
Dr. Stefano Pizzolitto
Direttore della Struttura Operativa Complessa di Anatomia Patologica - Azienda Ospedaliero-Universitaria Santa Maria della Misericordia – Udine
Dr.ssa Giovanna De Maglio
Dirigente Biologo della Struttura Operativa Complessa di Anatomia Patologica - Azienda Ospedaliero-Universitaria Santa Maria della Misericordia – Udine





diatech newsletter
numero 7 | febbraio | 2010

In questa nuova newsletter siamo lieti di ospitare il Prof. Mauro Magnani, Professore ordinario di Biochimica presso l’Università degli Studi di Urbino “Carlo Bo”, che da anni si occupa di ricerca nel campo della genomica e si distingue nella comunità scientifica internazionale con più di 300 pubblicazioni di elevatissimo livello e numerosi brevetti.

KRAS: non solo 12-13...

Le mutazioni nei codoni 12 e 13 del gene KRAS sono associate alla sua attivazione costitutiva e sono considerate responsabili della resistenza al trattamento con anticorpi monoclonali (moAbs) anti-EGFR, quali il cetuximab e il panitumumab, nei pazienti con tumore colorettale metastatico 1-3. Meta-analisi e dati presenti nella letteratura scientifica hanno chiaramente documentato che le sole mutazioni nei codoni 12 e 13 di KRAS non sono sufficienti a predire la resistenza al trattamento con moAbs anti-EGFR, suggerendo la necessità di identificare ulteriori marcatori di farmacoresistenza 4.
La presenza della mutazione V600E nel gene BRAF, mutualmente esclusiva con quelle presenti nei codoni 12 e 13 del gene KRAS, certamente spiega parte delle resistenze agli anticorpi monoclonali anti-EGFR, tuttavia occorre individuare ulteriori marcatori molecolari che possano giustificare la resistenza al cetuximab o al panitumumab nei pazienti che non presentano mutazioni né nei codoni 12 e 13 di KRAS, né nell’esone 600 di BRAF.

Altre mutazioni del gene KRAS, che interessano i codoni 61 e 146, sono note essere responsabili della sua attivazione costitutiva 5-7. Appare così rilevante verificare se vi siano mutazioni nei codoni 61 e 146, quando i codoni 12 e 13 sono wild-type. In uno studio pubblicato di recente, Loupakis et al hanno analizzato lo stato mutazionale del gene KRAS nei codoni 61 e 146 in 87 pazienti con tumore colorettale metastatico, trattati con cetuximab e irinotecan secondo gli schemi terapeutici classici, e risultati wild-type per i codoni 12 e 13. Tra gli 87 pazienti analizzati 8 erano portatori di mutazioni nei codoni 61 o 146 e di questi nessuno aveva risposto alla terapia 8.

In considerazione del fatto che mediamente solo il 35% dei pazienti con KRAS wild-type per i codoni 12 e 13 risponde alla terapia con moAbs anti-EGFR, appare rilevante estendere l’indagine ad altri fattori predittivi per il successo delle terapie con cetuximab o panitumumab. Le evidenze sperimentali indicano un ruolo predittivo di resistenza ai moAbs anti-EGFR non solo per BRAF V600E, ma anche per le mutazioni dei codoni 61 e 146 di KRAS. Mutazioni in questi codoni sono associate anche ad un esito peggiore in termini di PSF e OS.

In conclusione, riteniamo che sia utile indagare anche lo stato mutazionale dei codoni 61 e 146 di KRAS per una più accurata selezione dei pazienti responsivi alle terapie con anticorpi monoclonali anti-EGFR.

Riferimenti bibliografici
1.       Karapetis CS, Khambata-Ford S, Jonker DJ, O’Callaghan CJ, Tu D, Tebbutt NC, Simes RJ, Chalchal H, Shapiro JD, Robitaille S, Price TJ, Shepherd L, Au HJ, Langer C, Moore MJ, Zalcberg JR. K-ras mutations and benefit from cetuximab in advanced colorectal cancer. N Engl J Med 359(17): 1757-1765 (2008)
2.       Amado RG, Wolf M, Peeters M, Van CE, Siena S, Freeman DJ, Juan T, Sikorski R, Suggs S, Radinsky R, Patterson SD, Chang DD. Wild-type KRAS is required for panitumumab efficacy in patients with metastatic colorectal cancer. J Clin Oncol 26:1626-1634 (2008)
3.       Allegra CJ, Jessup JM, Somerfield MR, Hamilton SR, Hammond EH, Hayes DF, McAllister PK, Morton RF, Schilsky RL. American Society of Clinical Oncology provisional clinical opinion: testing for KRAS gene mutations in patients with metastatic colorectal carcinoma to predict response to anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antibody therapy. J Clin Oncol 27(12): 2091-2096 (2009)
4.       Linardou H, Dahabreh I, Kanaloupiti D, Siannis F, Bafaloukos D, Kosmidis P, Papadimitriou CA, Murray S. Assessment of somatic k-RAS mutations as a mechanism associated with resistance to EGFR-targeted agents: a systematic review and meta-analysis of studies in advanced non-small-cell lung cancer and metastatic colorectal cancer. Lancet Oncol 9(10): 962-972 (2008)
5.       Edkins S, O’Mehara S, Parker A, Stevens C, Reis M et al. Recurrent KRAS codon 146 mutations in human colorectal cancer. Cancer Biol Ther 5: 928-932 (2006)
6.       Albitar M, Yeh C, Ma W. K-ras mutations and cetuximab in colorectal cancer [letter to editor]. N Engl J Med 360: 834 (2009)
7.       Lambrechts D, De Roock W, Prenen H, De Schutter J, Jacobs B, Biesmans B, Claes B, De Hertogh G, Van Cutsem E, Tejpar S. The role of KRAS, BRAF, NRAS, and PIK3CA mutations as markers of resistance to cetuximab in chemorefractory metastatic colorectal cancer. Abstract N. 4020 ASCO 2009
8.       Loupakis F, Ruzzo A, Cremolini C, Vincenzi B, Salvatore L, Santini D, Masi G, Stasi I, Canestrari E, Rulli E, Floriani I, Bencardino K, Galluccio N, Catalano V, Tonini G, Magnani M, Fontanini G, Basolo F, Falcone A, Graziano F. KRAS codon 61, 146 and BRAF mutations predict resistance to cetuximab plus irinotecan in KRAS codon 12 and 13 wild-type metastatic colorectal cancer. Br J Cancer 101: 715-721 (2009)

Si ringraziano il Prof. Mauro Magnani e la Dr.ssa Anna Maria Ruzzo del Dipartimento di Scienze Biomolecolari dell’Università di Urbino “Carlo Bo”.

Per maggiori informazioni vi invitiamo a consultare il file allegato alla newsletter (in alternativa scaricabile qui).




KRAS

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numero 1 | maggio | 2009

_ I tumori solidi sono tipicamente tessuti eterogenei che contengono cellule tumorali mescolate a cellule non neoplastiche, incluse cellule della risposta infiammatoria, cellule endoteliali e mesenchimali. Il rilevamento di mutazioni in oncogeni come il KRAS rappresenta una vera e propria sfida. Non solo ogni cellula non-neoplastica contribuisce con due alleli wild-type, ma anche uno dei due alleli di una cellula tumorale può essere wild-type. Questo problema è particolarmente evidente nei tumori con abbondante stroma desmoplastico circondante una minoranza di cellule tumorali o con numerose cellule infiammatorie, o nei tumori in cui le cellule carcinomatose invasive sono particolarmente scarse soprattutto dopo la somministrazione di chemioterapici o terapia radiante.

_ Il sequenziamento del DNA con dideossi terminatori è il metodo più comunemente usato e rappresenta al momento il protocollo di riferimento per l’analisi mutazionale di KRAS; tuttavia può non essere capace di rilevare una minoranza di alleli mutati presenti in un background di abbondanti sequenze wild-type. Si stima, infatti, che la sensibilità del sequenziamento tradizionale sia tale da permettere l’individuazione di mutazioni quando le copie di DNA mutato rappresentano il 20-25% del totale. Pertanto un metodo di sequenziamento del DNA sensibile, efficiente ed applicabile ad un ampio numero di campioni è necessario per il rilevamento delle mutazioni del gene KRAS.

_ Il Pyrosequencing ovvero un sequenziamento real-time mediante estensione nucleotidica, non-elettroforetico, rappresenta un nuovo strumento semplice, robusto e sensibile per l’analisi mutazionale del KRAS. Infatti, nello studio comparativo di Ogino et al. del 2005 (vedi allegati I-IX), il Pyrosequencing ha dimostrato una sensibilità superiore a quella del sequenziamento secondo Sanger nel rilevamento di mutazioni KRAS nei tessuti paraffinati sia di carcinomi colo-rettali, sia di tumori pancreatici. Inoltre, dalla valutazione di varie miscele di DNA da linee cellulari KRAS mutate e DNA da linee cellulari KRAS wild-type, il limite di rilevamento di alleli mutati del Pyrosequencing è risultato approssimativamente del 5%. Un ulteriore considerevole vantaggio del Pyrosequencing è la possibilità di eseguire un’accurata quantificazione allelica, che permette un oggettivo controllo di qualità dei dati ed un facile monitoraggio delle performance del saggio.

per maggiori informazioni, vi invitiamo a consultare il file allegato alla Newsletter (scaricabile qui).

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